Desarrollo de estrategias de seleccion de ovocitos bovinos para mejorar la produccion in vitro de embriones y la transgenesis animal

Abstract

Los sistemas de producción in vitro (PIV) de embriones se utilizan tanto para fines productivos como para generar embriones necesarios para la investigación científica. Sin embargo, la eficiencia de la PIV de embriones en especies ganaderas, medida como la proporción de ovocitos inmaduros que alcanzan el estadio de blastocisto, rara vez supera el 30- 40%. En bovinos, una de las principales razones de este bajo porcentaje tiene que ver con la heterogeneidad en la calidad de los ovocitos que provienen de ovarios de animales sacrificados en mataderos. Para mejorar la eficiencia de la PIV resulta necesario identificar variables predictivas del estado funcional de los ovocitos antes de la maduración in vitro (MIV), evaluar la capacidad de maduración de estos y las características posteriores a la MIV. Sobre la base de estos antecedentes, el objetivo general de este trabajo es realizar una caracterización morfológica, cuantitativa y biológica de ovarios y ovocitos provenientes de animales destinados a faena con el fin de establecer métodos sencillos y no invasivos de selección de ovocitos competentes para ser utilizados en tecnologías de reproducción in vitro. Fue posible caracterizar morfológica y biológicamente tanto los ovarios como sus complejos cúmulus-ovocito (COCs) y ovocitos provenientes de un frigorífico local. Alrededor del 90 % resultaron ser ovocitos y COCs de buena calidad para ser utilizados en ensayos de PIV. Posterior a la MIV, las medidas determinadas de área, perímetro y diámetro del ooplasma, espesor de la zona pelúcida (ZP) y expansión de las células del cúmulus (CC) fueron significativamente superiores a las determinadas previo a la MIV. También se evaluó la incidencia de la morfología del primer cuerpo polar (CP) en parámetros como viabilidad, producción de especies reactivas del oxígeno (ERO) y distribución de gránulos corticales (GC). Los resultados mostraron que la morfología del primer CP está relacionada con las variables indicativas de calidad mencionadas y, por lo tanto, pudo concluirse que la morfología del primer cuerpo polar es un método relativamente sencillo y no invasivo que permite identificar ovocitos bovinos maduros de calidad, supuestamente con mayor probabilidad de promover el desarrollo embrionario. Finalmente, se desarrolló un sistema transgénico en células bovinas en cultivo, basado en el transposón Sleeping Beauty, para mediar la integración genómica de secuencias que codifican la desaturasa mFAT2. Los vertebrados son incapaces de sintetizar ácidos grasos (AG) poliinsaturados. Contrariamente, el nematodo C. elegans puede sintetizarlos ya que cuenta con las desaturasas necesarias para dicho proceso. En este trabajo, se logró transfectar con éxito células bovinas MAC-T con el gen de la desaturasa mencionada, mediante el sistema transposón Sleeping Beauty. Las líneas celulares bovinas transgénicas que expresaron establemente la enzima mFAT2 mostraron un perfil lipídico con presencia de AG poliinsaturados. Sobre la base de todos estos resultados se espera lograr en un futuro una mejor eficiencia en las tecnologías de reproducción in vitro en especies ganaderas mediante una selección cuidadosa de ovocitos previo a la MIV y luego de la MIV identificar los de mejor calidad de acuerdo a la morfología del primer CP. Sumado a esto, a partir del sistema transgénico desarrollado podrían obtenerse animales portadores del gen de la desaturasa para producir leche con un mejor perfil lipídico para el consumo humano.